I.서 론

음양곽(Epimedii Herba)은 삼지구엽초 또는 기타 동속 식 물(매자나무과; Berberidaceae)의 지상부를 건조한 것을 말 하며(Cho et al. 2015) 종류로는 삼지구엽초(Epimedium koreanum Nakai) 외에 유모음양곽(Epimedium pubescens Maximowicz), 음양곽(Epimedium brevicornum Maximowicz), 무산음양곽(Epimedium wushanense T.S. Ying), 전엽음양곽 (Epimedium sagittatum Maximowicz)이 있다(Oh et al. 2013; Wu et al. 2016). 삼지구엽초는 한국, 중국에서 전통적 인 약초의 하나로 사용되어 왔으며(Cho et al. 2015), 한국에 서는 강원도, 경기도, 평안남도, 함경남도 및 함경북도 등에 자생하며 약용으로 이용되는데 가는 줄기에서 3개의 가지가 뻗어나와있고 각 가지마다 3개의 잎이 달려 있어 삼지구엽 초라고 부른다(Zhang et al. 2013). 최근 연구에서 삼지구엽 초는 불임, 발기부전, 신경쇠약, 항염증, 고혈압, 항산화 및 종양 억제 활성이 보고되었으며(Huang et al. 2016), 항바이 러스 기능, 면역 증진 효과(Cho et al. 2015), 피부암 저해 (Ken et al. 2016), 골밀도 증가를 통한 골다공증 예방 (Zhang et al. 2013)과 성호르몬인 estradiol 수치를 증가시킨 다고 보고된 바 있다(Cho et al. 2015; Liu et al. 2014).

삼지구엽초의 대표적인 성분은 플라보노이드계열 물질로 icariin, icaritin, epimedoside A, quercetin, anhydroicaritin- 3-O-α-rhamnoside, epimedoside C, icariside I, icariside II, ikarisoside A-F 및 Epimedin A-C 등이 보고되었다(Kim et al. 2011; Guon et al. 2014). 그 중에서도 이카린(icariin)은 삼지구엽초에 가장 많이 함유되어 있는 기능성 물질로(Song et al. 2013), 간, 관절 및 신기능 부전에 치료제로 알려져 있 으며, 최근에는 폐경기 여성의 골 손실 예방(Huang et al. 2007) 심혈관계질환, 당뇨 및 면역조절에도 도움이 된다고 보고되었다(Cho et al. 2015). 최근 퇴행성 신경질환의 발병 과 건강에 대한 관심의 증가로 기능성 식물에 대한 연구가 활발하게 이루어지고 있으며(Joung et al. 2007), 천연 식물 추출물은 유기합성 물질에 비하여 인체에 대한 독성과 부작 용으로부터 안전하여 천연 항산화제로서의 가치를 인정받고 있다(Kang et al. 2010; Cho et al. 2015). 기존에 삼지구엽 초의 다양한 플라보노이드 물질의 정량 및 정성분석에 대한 연구(Chen et al. 2007)와 삼지구엽초 추출물의 항산화 활성 연구(Kim et al. 1994; Zhang et al. 2013; Jang et al. 2017)들이 보고되었지만 삼지구엽초에 함유된 플라보노이드 의 항산화능 및 세포 보호효과에 대한 연구는 매우 미비한 실정이다. 따라서 본 연구에서는 삼지구엽초 추출물의 항산 화 활성을 측정하였으며, 그 항산화 활성이 삼지구엽초의 어 떤 기능성 플라보노이드로부터 기인한 것인지를 확인하기 위 하여 200 μg/mL의 농도에서 이카린, 이카리사이드(icariside I), 이카리사이드 II(icariside II), 이카리틴(icaritin), 에피메딘 A (epimedin A), 에피메딘 B (epimedin B) 및 에피메딘 C (epimedin C)의 DPPH 라디칼 소거 활성을 비교한 후, 가장 좋은 활성을 나타낸 이카린과 이카리사이드의 항산화 활성 을 측정하였으며, 삼지구엽초 추출물과 두 플라보노이드의 PC12 세포 보호효과를 확인하였다.

II.연구 내용 및 방법

1.실험 재료

본 실험에 사용된 삼지구엽초(Epimedium koreanum Nakai) 는 강원도 홍천에서 채집된 후 건조된 것을 2015년 3월 서 울 경동시장에서 구입하였으며, 잎 부분을 분쇄기(FM-681, Hanil Co., Changwon, Korea)를 이용하여 분쇄하였다.

물과 혼합한 유기용매는 100% 에탄올 및 메탄올 용매보 다 페놀성 물질의 용해를 증가시킨다(Hong et al. 2011; Jun et al. 2014). 따라서 본 실험에서는 시료 추출 용매로 70% 에탄올을 사용하였다.

분말 상태의 시료 무게 20 g에 중량 대비 10배량의 200 mL의 70% 에탄올을 넣고, 50에 150 rpm으로 진탕배양기 (BF-30SI, Biofree Co., Ltd., Gyeonggi-do, Korea)에 24시 간 동안 추출한 후에 여과과정을 거친 후 감압농축기 (EYELA N-1000, Riakikiai Co., Ltd., Tokyo, Japan)를 이 용하여 농축하였다.

2.실험 농도

항산화 활성 평가를 위한 농도는 Chen et al.(2007)의 삼 지구엽초의 이카린 정량 분석 결과를 참고하였다. 정량 분석 결과 삼지구엽초 1000 μg/mL 당 약 61.4-92.6 μg/mL의 이 카린을 함유하고 있는 것으로 나타났다. 따라서 본 연구에서 는 삼지구엽초 250-1000 μg/mL에 함유되어 있는 이카린 및 이카리사이드 I 의 항산화 활성 평가 실험 농도를 12.5-100 μg/mL 로 설정하였다.

3.DPPH 라디칼 소거 활성

각 시료의 DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) 라디칼 소거 활성은 안정한 라디칼인 DPPH에 대한 전자공여효과 (electron donating ability)를 통해 환원력을 측정하는 실험법 으로 본 연구에서는 Ramos et al.(2003)의 방법을 본 시료에 맞게 변형하여 측정하였다. 0.3 mM DPPH 시료를 각 농도 별 삼지구엽초 추출물, 이카린 그리고 이카리사이드 I 과 반 응한 후 30분 뒤에 515 nm에서 흡광도를 측정하였다. 각 실 험은 3회 반복하여 시행했으며 평균값을 제시하여 아래의 식 으로 라디칼 소거 활성을 확인하였다.

DPPH 라디칼 소거 활성(%)=(1−A/B)100

A: 시료첨가구의 흡광도, B: 시료 미첨가구의 흡광도

4.ABTS 라디칼 소거 활성

ABTS(2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)) 라디칼 소거활성은 Re et al.(1999)의 방법을 본 시료에 맞게 변형하여 측정하였다. ABTS 7.4 mM과 potassium persulfate 2.6 mM 1:1 (v/v)의 비율로 혼합한 뒤, 24시간 동안 암소에 방치하여 stoCk solution을 제조하였다. 이후 phosphate buffer saline (pH 7.4)에 ABTS용액을 넣어 735 nm에서 흡광도 값 이 0.7±0.03가 나오도록 희석하였으며. 희석한 용액에 농도 별 시료를 가하여 10분간 반응시킨 후 735 nm에서 흡광도를 측정하였다. 모든 실험은 3반복 실행하여 평균값을 제시하였 고 아래의 식으로 ABTS 라디칼 소거 활성을 계산하였다.

A: 시료첨가구의 흡광도, B: 시료 미첨가구의 흡광도

5.Ferric reducing antioxidant power (FRAP)

FRAP (ferric reducing ability power) 실험은 Benzie & Strain(1996)의 방법을 본 시료에 맞게 변형하여 측정하였다. 0.3M sodium acetate buffer (pH 3.6)와 40 mM HCL에 용 해시킨 10 mM 2,4,6-tripyridyl-S-triazine (TPTZ), 그리고 20 mM FeCl₃ 용액을 10:1:1 (v/v/v)의 비율로 혼합하여 37°C에 서 15분간 반응시켜 FRAP reagent를 만들었다. 농도별 시료 에 FRAP reagent을 가하여 실온에서 20분간 암소에서 반응 시킨 후 593 nm에서 흡광도를 측정하였다. 실험은 3반복 실 행하여 평균값을 제시하였다.

6.세포 배양

본 실험에서 사용한 PC12 세포는 쥐의 pheochromocytoma 에서 유도되었으며, 신경세포의 특성을 나타내는 세포로 한 국세포주은행(KCLB)에서 분양받아 사용하였다. PC12 세포 는 25 mM sodium bicarbonate, 5% fetal bovine serum, 10% horse serum, 50 units/mL penicillin 및 100 μg/mL streptomycin을 포함하는 RPMI 1640배지에 접종하여 37°C, 5% CO₂ 조건에서 24-48시간 배양하였다.

7.세포 내 산화적 스트레스 억제 효과

H₂O₂ (hydrogen peroxide)로 유도한 PC12 세포의 산화적 스트레스 억제 효과는 MTT assay로 측정하였다. PC12 세포 는 96 well plate에 4×10⁴ cell/well로 분주하고 48시간 후 H₂O₂를 final concentration 250 μM로 3시간 동안 처리하였 다. 이 상태의 PC12 세포에 MTT stoCk solution을 처리하 여 37°C에서 3시간 동안 방치한 후, 보라색으로 염색된 formazan을 DMSO로 용해시켜 570 nm에서 흡광도를 측정 하였다. 세포 생존률은 대조구에 대한 %값으로 나타내었다.

8.통계처리

모든 실험은 3회 반복 실시하여 평균값과 표준편차를 제 시하였다. 또한 SPSS (Statistical Package for Social Science, ver. 18, IBM, Chicago IL. USA)를 이용하여 p<0.05 수준 에서 student t-test로 대조군과의 유의성을 확인하였으며, ANOVA test를 통해 각 군간의 유의성을 확인한 후 Duncan’s multiple range test로 각 군의 평균 차이를 분석하였다.

III.결과 및 고찰

1.DPPH 라디칼 소거 활성

기존에 삼지구엽초를 이용한 항산화 연구가 다수 이루어 진 바 있지만(Kim et al. 2011; Kim et al. 1994), 삼지구엽 초에 함유된 물질 중 항산화 효과에 가장 큰 영향을 나타내 는 물질이 무엇인지 규명하는 연구는 매우 부족한 실정이다. 따라서 본 연구에서는 삼지구엽초 내의 다양한 플라보노이 드 배당체들 중에서 항산화 효과에 가장 크게 기여하는 물 질을 확인하기 위하여 DPPH 실험법을 통해 삼지구엽초의 주요 기능성 물질로 보고된 이카린, 이카리사이드 I, 이카리 사이드 II, 이카리틴, 에피메딘 A-C의의 라디칼 소거 활성을 스크리닝 하였다. 7개의 플라보노이드 성분들 중 이카린과 이카리사이드는 200 μg/mL에서 각각 57.8%와 59.2%로 가 장 우수한 라디칼 소거능을 보였으며<Figure 1>, 위 실험 결 과를 바탕으로 삼지구엽초 추출물과 이카린 및 이카리사이 드 의 항산화 활성을 측정하였다.

DPPH 실험법은 안정한 DPPH 라디칼이 함황 아미노산과 방향족 화합물 및 아민류의 전자공여능으로 환원되어 에탄 올 용액에서 짙은 보라색을 띠다가 항산화 물질과 반응하면 노란색으로 탈색되는 원리를 이용한 대표적인 항산화능 측 정법이다(Park et al. 2015; Lee et al. 2016).

삼지구엽초 추출물, 이카린과 이카리사이드의 DPPH 라디 칼 소거능 결과는 <Figure 2>와 같다. 삼지구엽초 추출물, 이카린 및 이카리사이드 I은 모두 농도 의존적으로 라디칼 소거 활성이 증가하였으며, 삼지구엽초 추출물은 1000 μg/ mL 의 농도에서 41.7%의 라디칼 소거능을, 이카린은 및 이 카리사이드 은 100 μg/mL의 농도에서 각각 40.6, 43.7%로 나타났다. Kim et al.(2011)의 연구결과에 의하면 에탄올로 추출한 삼지구엽초 에틸아세테이트 분획물(49 μg/g)에서 50% 의 라디칼 소거능을 보여 본 연구의 결과보다 다소 우수한 활성을 나타내었는데, 이는 에틸아세테이드가 플라보노이드 와 같은 페놀성 화합물을 잘 용해시키기 때문에 유기용매로 만 추출한 것보다 에틸아세테이트 분획층에서 상대적으로 더 많은 페놀성 화합물이 함유되어 있을 것으로 사료된다(Hong et al. 2011; Jun et al. 2014).

2.ABTS 라디칼 소거 활성

ABTS 라디칼 소거 활성법은 ABTS가 potassium persulfate 와 반응하여 생성된 청록색이 항산화 물질과 만나 탈색되는 원리를 이용하여 측정하는 방법이다(Jang et al. 2017). 삼지 구엽초 추출물, 이카린 및 이카리사이드 I의 라디칼 소거 활 성 결과는 <Figure 3>과 같다. ABTS 라디칼 소거 활성은 모든 시료에서 농도 의존적으로 우수한 활성을 보였으며, 삼 지구엽초 추출물은 1000 μg/mL에서 88.8%, 이카린과 이카 리사이드 I은 100 μg/mL의 농도에서 각각 90.5, 91.0%의 라디칼 소거능을 보였다. 본 실험에서는 ABTS 실험 결과가 DPPH 실험 결과보다 저농도에서 더 높은 라디칼 소거능을 보였는데, Lee et al.(2016)의 연구에서도 부위별 삼지구엽초 추출물의 ABTS 라디칼 소거 활성이 DPPH 라디칼 소거 활 성보다 더 높은 활성을 보였으며, Jang et al.(2017)의 연구 에서 역시 삼지구엽초 담금주의 ABTS 라디칼 소거 활성이 DPPH 라디칼 소거 활성에 비해 높은 활성을 나타내어 본 연구와 유사한 결과를 보였다. 이러한 결과는 DPPH 실험이 소수성 물질의 항산화능 측정에 적합한 반면, ABTS 실험은 친수성 및 소수성 물질의 항산화능 측정이 모두 가능하므로 ABTS에서 높은 라디칼 활성이 나타났을 것으로 사료된다 (Floegel et al. 2011).

3.FRAP

FRAP 실험은 철 이온의 환원력을 측정하는 방법으로, 항 산화제와 반응한 ferric tripyridyltriazine (Fe3+-TPTZ) 복합 체는 ferrous tripytidyl triazine (Fe²⁺-TPTZ)으로 환원이 되 어 푸른색으로 발색된다. 그 발색 정도가 높을수록 높은 환 원력을 가지며, 흡광도 값을 통해 해당 시료의 항산화력을 확인 할 수 있다(Cheng et al. 2013; Kang 2012).

본 연구의 삼지구엽초 추출물, 이카린 및 이카리사이드 I 의 FRAP 흡광도의 결과는 <Figure 4>와 같다. DPPH 및 ABTS 실험에서와 같이 모두 농도 의존적으로 활성이 증가 하는 결과를 보였다. 모든 항산화 실험법에서 이카린과 이카 리사이드 I을 각 농도별로 비교했을 때 이카리사이드 I이 통 계적으로 더 높은 항산화 활성을 보였다. 이러한 결과는 이 카린과 이카리사이드 의 구조적인 차이에 의한 것으로 사료 되는데, 이카린은 C환에 람노스와 A환에 글루코스를 갖고 있는 구조를 이루고 있으며<Figure 5>, 이카린의 분해산물인 이카리사이드 은 이카린의 B환에서 람노스가 떨어진 구조를 이루고 있다(Qian et al. 2012; Jang et al. 2017). Arora et al.(1998)는 플라보노이드의 C환에 붙은 작용기 따라 항산화 활성에 차이가 있으며, 플라보노이드의 C환의 세 번째 탄소 자리에 수산기가 붙은 쿼서틴(Quercetin)이 이당류인 루티노 스(rutinose)가 붙어 있는 루틴보다 높은 항산화 활성을 나타 냈다 보고했다. 이에 이카린과 이카리사이드 의 C환에 붙은 작용기의 차이가 항산화활성에 기여한 것으로 판단된다.

본 연구에서 사용한 세 가지 항산화 실험 결과, 삼지구엽 초 추출물, 이카린 및 이카리사이드 I 모두 농도 의존적으로 라디칼 소거 활성이 증가했으며, 우수한 항산화 활성이 확인 되어 세포내 항산화 효과를 측정하기 위해 산화적 스트레스 에 대한 PC12 세포 보호효과를 측정하였다.

4.세포 독성 확인 및 산화적 스트레스에 대한 세포 보호 효과

산화적 스트레스에 의한 신경세포의 사멸은 다양한 퇴행 성 질환을 유발할 수 있으며 플라보노이드는 천연 항산화제 로서 우수한 신경세포 보호 효과가 있는 것으로 알려져 있 다(Park et al. 2014). 삼지구엽초 추출물, 이카린 및 이카리 사이드 I의 라디칼 소거 결과를 바탕으로 세포 내에서의 항 산화 활성을 확인하기 위해 PC12 세포에 H₂O₂를 처리하여 산화적 스트레스를 유도한 후 세포 보호 효과를 확인하였다. 삼지구엽초 추출물에 대한 PC12 세포 독성을 확인한 결과 는 <Figure 6>과 같다. 삼지구엽초 추출물 처리 시, 200 μg/mL에서 121.6%로 아무것도 처리하지 않은 대조군 대비 가장 높은 세포 생존율을 보였다. 따라서 본 실험에서는 삼 지구엽초 추출물의 농도를 50-200 μg/mL까지 설정하였으며, 해당 농도에 함유되어 있는 이카린 및 이카리사이드 I은 5- 20 μg/mL의 농도에서 세포 생존율을 확인하였다<Figure 7>. 이카린을 처리한 군의 경우 20 μg/mL의 농도에서 124.7%의 생존율을 보였으며, 이카리사이드 을 처리한 군은 20 μg/mL 에서 131.4%의 생존율을 보였다. 위 실험결과를 바탕으로 산 화적 스트레스의 일종인 H₂O₂에 대한 세포 보호 효과를 측 정하였다.

삼지구엽초 추출물, 이카린 그리고 이카리사이드 I의 산화 적 스트레스에 대한 농도별 세포 보호 효과의 결과는 <Figure 8>과 같다. PC12 세포에 H₂O₂를 처리한 결과, 대 조군 대비 47.4%까지 세포가 사멸하였으며 이카린 처리군은 20 μg/mL에서 52.7%, 이카리사이드 I 처리군은 20 μg/mL에 서 50.6%의 세포 보호 효과를 보였다. 한편, 200 μg/mL의 삼지구엽초 추출물에 노출시킨 PC12 세포는 62.5%의 가장 높은 세포보호 효과를 보였다. Liu et. al.(2014)의 연구에 의 하면 음양곽 내의 플라보노이드인 이카리사이드 II와 이카린 이 함께 작용하면 상승작용을 통하여 파골세포의 성장을 억 제한다고 보고하였는데, 본 연구 결과 또한 삼지구엽초 추출 물에 존재하는 다양한 플라보노이드가 함께 작용하여 상승 효과가 나타났을 것으로 사료된다.

본 실험에서 삼지구엽초 추출물, 이카린 및 이카리사이드 I의 항산화 활성 및 세포 보호 효과를 확인하였다. DPPH, ABTS 및 FRAP 실험 결과, 삼지구엽초 추출물, 이카린 및 이카리사이드 I에서 모두 농도 의존적으로 라디칼 소거 활 성이 증가하는 경향을 보였으며, H₂O₂에 대한 PC12 세포 보 호 실험에서도 모두 세포 보호 효과를 확인할 수 있었다.

Lim et al.(2007)은 삼지구엽초 물 추출물(25 mg/kg body weight/day)을 장기간 먹인 쥐의 항산화 효과를 확인한 결과, 삼지구엽초 물 추출물을 섭취한 군이 대조군에 비해 항산화 효소인 SOD (superoxide dismutase), Catalase, GSH (glutathione) peroxidase가 더 오랜 기간 유지되어 삼지구엽초 물 추출물 의 항산화 효과를 보고하였다. 한편, 이카린은 섭취 시 인체 에서 흡수, 대사, 배설 및 독성 등이 입증되지 않은 상태로 섭취시 안전성에 대한 입증이 필요하다(Yun et al. 2016).

아직까지 삼지구엽초의 기능성 지표물질인 이카린과 그 분 해산물인 이카리사이드 I의 구조적인 특징 및 활성에 대한 연구가 부족한 실정이다. 따라서 그 차이에 따른 항산화 활 성 연구가 요구되며, 앞으로 삼지구엽초 및 이카린과 이카리 사이드 I의 분자생물학적인 연구를 통하여 산화적 스트레스 에 대한 PC12 세포 보호 기전에 대한 규명이 이어져야 할 것으로 생각된다.

IV.결론 및 요약

본 연구에서는 삼지구엽초(Epimedium koreanum Nakai), 삼지구엽초의 플라보노이드 배당체인 이카린과 이카리사이드 I의 항산화 활성을 확인하기 위해 DPPH, ABTS 및 FRAP 실 험을 실시하였으며, H₂O₂로 유도한 PC12 세포를 이용하여 산 화적 스트레스에 대한 세포 보호 효과를 확인하였다. 추출 용 매로는 70% 에탄올을 사용하였으며 DPPH 실험을 통해 7개 의 삼지구엽초의 플라보노이드 배당체의 라디칼 소거능을 스 크리닝 하였으며, 그 중 이카린과 이카리사이드 I에서 가장 두드러진 활성을 보이는 것을 확인했다. 그 후, 삼지구엽초 추 출물, 이카린 및 이카리사이드 I을 이용하여 DPPH, ABTS 그리고 FRAP 실험을 진행하였으며, 세 실험에서 모두 농도 의존적으로 활성이 증가하는 결과를 보였다. H₂O₂로 유도한 PC12 세포 보호 실험결과 삼지구엽초 추출물은 100 μg/mL, 이카리사이드 I 및 이카린은 20 μg/mL 농도까지 세포 보호 효과를 보였다. 현재 삼지구엽초의 지표물질로 이카린이 많이 알려져 있는데, 본 연구를 통해 이카린의 분해산물인 이카리 사이드 I의 기능적 효과를 확인할 수 있었다.